胚胎干细胞微环境增强人角膜缘干细胞的干性 和抑制凋亡的机制

更新时间:2015-08-18

【摘要】背景成体干细胞的命运与其生存的微环境密切相关。研究表明，胚胎干细胞( ESCs)微环境能增强人角膜缘干细胞( LSCs)的干性，其作用机制是研究热点。  目的  探讨干细胞微环境增强LSCs的干性及其抑制细胞凋亡的分子机制。  方法将129小鼠ES细胞株（E14细胞）分别用CnT-20培养液和CnT-20+体积分数20% ES( ESC-CM)培养液进行培养和传代。采用新鲜供体人角膜缘组织块培养法，分别用CnT-20培养液和ESC-CM培养液培养和传代LSCs，细胞经固定后于光学显微镜下观察细胞克隆形态并计算克隆形成率( CFE)。ESC-CM培养组细胞分别转染端粒酶逆转录酶(TERT) siRNA( 19-25nt siRNA)或siRNA(sc一37007)，流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡、线粒体膜电位的改变；采用免疫荧光技术和流式细胞技术检测siRNA转染前后细胞中端粒酶的表达和活牲氧簇(ROS)的产生情况；采用RT-PCR、免疫荧光技术和Westernblot法检测细胞中干细胞标志物p63、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCC2)、整合素p，（integrin p，）和细胞分化标志物细胞角蛋白3( CK3) mRNA及其蛋白的表达；采用Western blot法检测细胞中黏着斑激酶( FAK)、Akt和糖原合成酶激酶3p(GSK3p)及其磷酸化蛋白以及p21蛋白的改变。

【关键词】 胚胎干细胞 微环境 端粒酶 角膜缘干细胞 信号通路 凋亡 克隆形成单位

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